改訂第３版 遺伝子工学実験ノート 下

第１章　DNAシークエンシング ー遺伝子の配列を読む

1 はじめに【松浦　徹】

2 アイソトープを用いるジデオキシ法（サンガー法）【松浦　徹】

2-1　原理

2-2　実際の手順

3 オートシークエンサー（ABI 310について）【松浦　薫】

第２章　プローブ作製法 ー遺伝子検出のアイテムをつくる【小西慶幸】

1 二本鎖DNAプローブ

1-1　ランダムプライマー法

2 末端標識プローブ

2-1　T4 ポリヌクレオチドキナーゼによる標識

2-2　クレノーフラグメントによる標識

2-3　T4 DNAポリメラーゼによる標識

3 RNA プローブ

4 合成オリゴヌクレオチドプローブ

5 カラムを用いたプローブの精製

5-1　ポリプレップカラムを用いた精製

5-2　スピンカラムを用いた精製

第３章　ゲノムDNAの解析 ー遺伝子構造を調べる

1 ゲノムDNAの調製【田村隆明】

1-1　SDS/フェノール法による精製

1-2　DNA精製用キットを用いる精製

2 サザンブロッティング【嶋田美穂】

2-1　制限酵素による断片化

2-2　アガロース電気泳動

2-3　ブロッティング

2-4　ハイブリダイゼーション

第４章　RNAの取扱いと調製 ー遺伝子発現解析の準備

1 RNAの取扱いについて【田村隆明】

1-1　RNA実験の前に

1-2　実験にとりかかる

2 RNAの抽出

2-1　出発材料の準備【青木　務】

2-2　AGPC法による抽出【青木　務】

2-3　細胞質RNAの抽出法（Nonidet® P-40を用いた抽出法）【青木　務】

2-4　RNeasy®キットを用いた方法【嶋田美穂】

2-5　TRIzol®を使う方法【田村隆明】

2-6　セシウム-超遠心法によるRNAの大量抽出【青木　務】

3 ポリA＋RNAの精製【青木　務】

3-1　Oligo-dT30 ラテックスビーズを用いる方法

3-2　Oligo-dTセルロースを用いたカラムクロマトグラフィー

第５章　遺伝子発現の解析

1 はじめに【青木　務】

2 ノーザンブロッティング【青木　務】

2-1　泳動とブロッティング

2-2　ハイブリダイゼーション

3 RNaseプロテクションアッセイ【嶋田美穂】

4 RT-PCR法【青木　務】

5 RACE法【青木　務】

5-1　5’RACE 法の原理

5-2　TdTを用いた5’RACE法

5-3　3’RACE法

6 リアルタイムPCR【小池千加】

6-1　リアルタイムPCRの原理

6-2　リアルタイムPCRと必要な準備

6-3　解析方法

7 DNAマイクロアレイ【関　直彦】

7-1　DNAマイクロアレイ開発の歴史

7-2　DNAマイクロアレイの基礎知識

7-3　DNAマイクロアレイによる遺伝子解析の流れ

7-4　DNAマイクロアレイを用いたゲノム医学解析への応用例

7-5　DNAマイクロアレイの展望

第６章　動物細胞へのDNA導入 ー遺伝子のはたらきを調べる①

1 DNA導入の基礎知識【田中祐司】

2 リポフェクション法

2-1　原理【田中祐司】

2-2　LipofectamineTM 2000を用いる方法【田中祐司】

2-3　HilyMaxを用いた方法【与五沢真吾】

2-4　Fugene® 6を用いる方法【田中祐司】

3 エレクトロポレーション【田中祐司】

4 ヌクレオフェクション【田中祐司】

5 リン酸カルシウム法【小西慶幸】

5-1　原理

5-2　実験方法

第７章　RNAiによる遺伝子抑制 ー遺伝子のはたらきを調べる②

1 はじめに【小西慶幸】

1-1　背景と原理

1-2　RNAiの手法

2 RNAi実験の準備【小西慶幸】

2-1　抑制配列の決定の基本

2-2　RNAi効果の評価方法

3 siRNAの調製

3-1　siRNA配列のデザイン【小西慶幸】

3-2　Silencer® siRNA Construction Kitを用いる【白石征士】

3-3　Stealth® RNAi【小西慶幸】

4 RNAiベクターの作製【小西慶幸】

4-1　pSUPER RNAi SystemTM

4-2　それ以外のベクター

5 細胞へのRNAi用核酸の導入

5-1　導入方法の検討【小西慶幸】

5-2　RNAi専用リポフェクション【与五沢真吾】

第８章　遺伝子情報の取得と解析 ーバイオデータベースを活用する【与五沢真吾】

1 はじめに

2 データベースへのアクセス-配列情報の取得

2-1　特定遺伝子および遺伝子産物の情報（DNA塩基配列，アミノ酸配列等）

2-2　SNP情報

2-3　プロモーター情報

2-4　スプライシング部位

3 ホモロジー（相同性）検索

4 おわりに