無敵のバイオテクニカルシリーズ

改訂第３版遺伝子工学実験ノート下

遺伝子の発現・機能を解析する

田村隆明／編
定価 3,900円＋税 2009年12月発行
A4判 216ページ　ISBN 978-4-89706-928-9

本号の概要
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RNAやゲノムDNAの抽出法から，リアルタイムPCRやRNAiなどの遺伝子解析法まで，バイオ研究に欠かせない実験が満載！イラストを用いた丁寧な解説で実験の原理とコツがしっかり身につきます！

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第１章　DNAシークエンシングー遺伝子の配列を読む

1 はじめに【松浦　徹】

2 アイソトープを用いるジデオキシ法（サンガー法）【松浦　徹】

2-1　原理

2-2　実際の手順

3 オートシークエンサー（ABI 310について）【松浦　薫】

セットアップ
ランの開始
データ解析
プリントアウトまたはデータの保存
メンテナンス

第２章　プローブ作製法ー遺伝子検出のアイテムをつくる【小西慶幸】

1 二本鎖DNAプローブ

1-1　ランダムプライマー法

2 末端標識プローブ

2-1　T4 ポリヌクレオチドキナーゼによる標識

2-2　クレノーフラグメントによる標識

2-3　T4 DNAポリメラーゼによる標識

3 RNA プローブ

4 合成オリゴヌクレオチドプローブ

5 カラムを用いたプローブの精製

5-1　ポリプレップカラムを用いた精製

5-2　スピンカラムを用いた精製

第３章　ゲノムDNAの解析ー遺伝子構造を調べる

1 ゲノムDNAの調製【田村隆明】

1-1　SDS/フェノール法による精製

1-2　DNA精製用キットを用いる精製

2 サザンブロッティング【嶋田美穂】

2-1　制限酵素による断片化

2-2　アガロース電気泳動

2-3　ブロッティング

キャピラリーブロッティング
エレクトロブロッティング

2-4　ハイブリダイゼーション

第４章　RNAの取扱いと調製ー遺伝子発現解析の準備

1 RNAの取扱いについて【田村隆明】

1-1　RNA実験の前に

RNAの物質的特徴
留意すべき事柄

1-2　実験にとりかかる

実験室とベンチ周辺の整備
器具，試薬を準備する

2 RNAの抽出

2-1　出発材料の準備【青木　務】

培養細胞の破砕
組織の破砕

2-2　AGPC法による抽出【青木　務】

2-3　細胞質RNAの抽出法（Nonidet® P-40を用いた抽出法）【青木　務】

2-4　RNeasy®キットを用いた方法【嶋田美穂】

2-5　TRIzol®を使う方法【田村隆明】

2-6　セシウム-超遠心法によるRNAの大量抽出【青木　務】

3 ポリA＋RNAの精製【青木　務】

3-1　Oligo-dT30 ラテックスビーズを用いる方法

3-2　Oligo-dTセルロースを用いたカラムクロマトグラフィー

第５章　遺伝子発現の解析

1 はじめに【青木　務】

2 ノーザンブロッティング【青木　務】

2-1　泳動とブロッティング

2-2　ハイブリダイゼーション

3 RNaseプロテクションアッセイ【嶋田美穂】

4 RT-PCR法【青木　務】

RNAの抽出
逆転写反応
PCR反応

5 RACE法【青木　務】

5-1　5’RACE 法の原理

5-2　TdTを用いた5’RACE法

逆転写反応
プライマーの除去
ホモポリマーの付加（Tailing）
PCR反応
PCR産物の検出と回収

5-3　3’RACE法

6 リアルタイムPCR【小池千加】

6-1　リアルタイムPCRの原理

SYBR® Green（サイバーグリーン）法
TaqMan®（タックマン）法

6-2　リアルタイムPCRと必要な準備

プライマー，プローブの設計
RNAサンプルのDNase処理
cDNA合成
リアルタイムPCR

6-3　解析方法

標準曲線の作成
融解曲線解析
Threshold line
Comparative Ct法（ΔΔCt法）

7 DNAマイクロアレイ【関　直彦】

7-1　DNAマイクロアレイ開発の歴史

7-2　DNAマイクロアレイの基礎知識

DNAマイクロアレイの種類と原理
DNAマイクロアレイを用いた遺伝子解析研究の組み立て方

7-3　DNAマイクロアレイによる遺伝子解析の流れ

7-4　DNAマイクロアレイを用いたゲノム医学解析への応用例

7-5　DNAマイクロアレイの展望

第６章　動物細胞へのDNA導入ー遺伝子のはたらきを調べる①

1 DNA導入の基礎知識【田中祐司】

はじめに
細胞へのDNA導入の意義
細胞へのDNA導入方法の種類
DNA導入を行う培養細胞について
DNA導入効率の検討について

2 リポフェクション法

2-1　原理【田中祐司】

2-2　LipofectamineTM 2000を用いる方法【田中祐司】

2-3　HilyMaxを用いた方法【与五沢真吾】

2-4　Fugene® 6を用いる方法【田中祐司】

3 エレクトロポレーション【田中祐司】

4 ヌクレオフェクション【田中祐司】

5 リン酸カルシウム法【小西慶幸】

5-1　原理

5-2　実験方法

第７章　RNAiによる遺伝子抑制ー遺伝子のはたらきを調べる②

1 はじめに【小西慶幸】

1-1　背景と原理

1-2　RNAiの手法

siRNA法
shRNA法

2 RNAi実験の準備【小西慶幸】

2-1　抑制配列の決定の基本

2-2　RNAi効果の評価方法

3 siRNAの調製

3-1　siRNA配列のデザイン【小西慶幸】

3-2　Silencer® siRNA Construction Kitを用いる【白石征士】

3-3　Stealth® RNAi【小西慶幸】

4 RNAiベクターの作製【小西慶幸】

4-1　pSUPER RNAi SystemTM

4-2　それ以外のベクター

5 細胞へのRNAi用核酸の導入

5-1　導入方法の検討【小西慶幸】

5-2　RNAi専用リポフェクション【与五沢真吾】

第８章　遺伝子情報の取得と解析ーバイオデータベースを活用する【与五沢真吾】

1 はじめに

2 データベースへのアクセス-配列情報の取得

2-1　特定遺伝子および遺伝子産物の情報（DNA塩基配列，アミノ酸配列等）

改訂第３版 遺伝子工学実験ノート 下

遺伝子の発現・機能を解析する

第１章 DNAシークエンシング ー遺伝子の配列を読む

1 はじめに【松浦 徹】

2 アイソトープを用いるジデオキシ法（サンガー法）【松浦 徹】

2-1 原理

2-2 実際の手順

3 オートシークエンサー（ABI 310について）【松浦 薫】

第２章 プローブ作製法 ー遺伝子検出のアイテムをつくる【小西慶幸】

1 二本鎖DNAプローブ

1-1 ランダムプライマー法

2 末端標識プローブ

2-1 T4 ポリヌクレオチドキナーゼによる標識

2-2 クレノーフラグメントによる標識

2-3 T4 DNAポリメラーゼによる標識

3 RNA プローブ

4 合成オリゴヌクレオチドプローブ

5 カラムを用いたプローブの精製

5-1 ポリプレップカラムを用いた精製

5-2 スピンカラムを用いた精製

第３章 ゲノムDNAの解析 ー遺伝子構造を調べる

1 ゲノムDNAの調製【田村隆明】

1-1 SDS/フェノール法による精製

1-2 DNA精製用キットを用いる精製

2 サザンブロッティング【嶋田美穂】

2-1 制限酵素による断片化

2-2 アガロース電気泳動

2-3 ブロッティング

2-4 ハイブリダイゼーション

第４章 RNAの取扱いと調製 ー遺伝子発現解析の準備

1 RNAの取扱いについて【田村隆明】

1-1 RNA実験の前に

1-2 実験にとりかかる

2 RNAの抽出

2-1 出発材料の準備【青木 務】

2-2 AGPC法による抽出【青木 務】

2-3 細胞質RNAの抽出法（Nonidet® P-40を用いた抽出法）【青木 務】

2-4 RNeasy®キットを用いた方法【嶋田美穂】

2-5 TRIzol®を使う方法【田村隆明】

2-6 セシウム-超遠心法によるRNAの大量抽出【青木 務】

3 ポリA＋RNAの精製【青木 務】

3-1 Oligo-dT30 ラテックスビーズを用いる方法

3-2 Oligo-dTセルロースを用いたカラムクロマトグラフィー

第５章 遺伝子発現の解析

1 はじめに【青木 務】

2 ノーザンブロッティング【青木 務】

2-1 泳動とブロッティング

2-2 ハイブリダイゼーション

3 RNaseプロテクションアッセイ【嶋田美穂】

4 RT-PCR法【青木 務】

5 RACE法【青木 務】

5-1 5’RACE 法の原理

5-2 TdTを用いた5’RACE法

5-3 3’RACE法

6 リアルタイムPCR【小池千加】

6-1 リアルタイムPCRの原理

6-2 リアルタイムPCRと必要な準備

6-3 解析方法

7 DNAマイクロアレイ【関 直彦】

7-1 DNAマイクロアレイ開発の歴史

7-2 DNAマイクロアレイの基礎知識

7-3 DNAマイクロアレイによる遺伝子解析の流れ

7-4 DNAマイクロアレイを用いたゲノム医学解析への応用例

7-5 DNAマイクロアレイの展望

第６章 動物細胞へのDNA導入 ー遺伝子のはたらきを調べる①

1 DNA導入の基礎知識【田中祐司】

2 リポフェクション法

2-1 原理【田中祐司】

2-2 LipofectamineTM 2000を用いる方法【田中祐司】

2-3 HilyMaxを用いた方法【与五沢真吾】

2-4 Fugene® 6を用いる方法【田中祐司】

3 エレクトロポレーション【田中祐司】

4 ヌクレオフェクション【田中祐司】

5 リン酸カルシウム法【小西慶幸】

5-1 原理

5-2 実験方法

第７章 RNAiによる遺伝子抑制 ー遺伝子のはたらきを調べる②

1 はじめに【小西慶幸】

1-1 背景と原理

1-2 RNAiの手法

改訂第３版遺伝子工学実験ノート下

第１章　DNAシークエンシングー遺伝子の配列を読む

1 はじめに【松浦　徹】

2 アイソトープを用いるジデオキシ法（サンガー法）【松浦　徹】

2-1　原理

2-2　実際の手順

3 オートシークエンサー（ABI 310について）【松浦　薫】

第２章　プローブ作製法ー遺伝子検出のアイテムをつくる【小西慶幸】

1-1　ランダムプライマー法

2-1　T4 ポリヌクレオチドキナーゼによる標識

2-2　クレノーフラグメントによる標識

2-3　T4 DNAポリメラーゼによる標識

5-1　ポリプレップカラムを用いた精製

5-2　スピンカラムを用いた精製

第３章　ゲノムDNAの解析ー遺伝子構造を調べる

1-1　SDS/フェノール法による精製

1-2　DNA精製用キットを用いる精製

2-1　制限酵素による断片化

2-2　アガロース電気泳動

2-3　ブロッティング

2-4　ハイブリダイゼーション

第４章　RNAの取扱いと調製ー遺伝子発現解析の準備

1-1　RNA実験の前に

1-2　実験にとりかかる

2-1　出発材料の準備【青木　務】

2-2　AGPC法による抽出【青木　務】

2-3　細胞質RNAの抽出法（Nonidet® P-40を用いた抽出法）【青木　務】

2-4　RNeasy®キットを用いた方法【嶋田美穂】

2-5　TRIzol®を使う方法【田村隆明】

2-6　セシウム-超遠心法によるRNAの大量抽出【青木　務】

3 ポリA＋RNAの精製【青木　務】

3-1　Oligo-dT30 ラテックスビーズを用いる方法

3-2　Oligo-dTセルロースを用いたカラムクロマトグラフィー

第５章　遺伝子発現の解析

1 はじめに【青木　務】

2 ノーザンブロッティング【青木　務】

2-1　泳動とブロッティング

2-2　ハイブリダイゼーション

4 RT-PCR法【青木　務】

5 RACE法【青木　務】

5-1　5’RACE 法の原理

5-2　TdTを用いた5’RACE法

5-3　3’RACE法

6-1　リアルタイムPCRの原理

6-2　リアルタイムPCRと必要な準備

6-3　解析方法

7 DNAマイクロアレイ【関　直彦】

7-1　DNAマイクロアレイ開発の歴史

7-2　DNAマイクロアレイの基礎知識

7-3　DNAマイクロアレイによる遺伝子解析の流れ

7-4　DNAマイクロアレイを用いたゲノム医学解析への応用例

7-5　DNAマイクロアレイの展望

第６章　動物細胞へのDNA導入ー遺伝子のはたらきを調べる①

2-1　原理【田中祐司】

2-2　LipofectamineTM 2000を用いる方法【田中祐司】

2-3　HilyMaxを用いた方法【与五沢真吾】

2-4　Fugene® 6を用いる方法【田中祐司】

5-1　原理

5-2　実験方法

第７章　RNAiによる遺伝子抑制ー遺伝子のはたらきを調べる②

1-1　背景と原理

1-2　RNAiの手法

2-1　抑制配列の決定の基本

2-2　RNAi効果の評価方法

3-1　siRNA配列のデザイン【小西慶幸】

3-2　Silencer® siRNA Construction Kitを用いる【白石征士】

3-3　Stealth® RNAi【小西慶幸】

4-1　pSUPER RNAi SystemTM

4-2　それ以外のベクター

5-1　導入方法の検討【小西慶幸】

5-2　RNAi専用リポフェクション【与五沢真吾】

第８章　遺伝子情報の取得と解析ーバイオデータベースを活用する【与五沢真吾】

2-1　特定遺伝子および遺伝子産物の情報（DNA塩基配列，アミノ酸配列等）

2-2　SNP情報

2-3　プロモーター情報

2-4　スプライシング部位