顕微鏡

市販されている一般の光学顕微鏡を用いる．通常の顕微鏡観察と同様，細胞観察の場合は倒立型が，組織・個体の場合は正立型が観察に向いているが基本はどちらでも細胞での発光観察は可能である．筆者は，倒立型はオリンパス社IX81とIX83を，正立型はオリンパス社BX61WIをベースにそれぞれ構築した経験がある^1）〜3）．正立型のうち対物レンズの垂直上にカメラが設置されたものは，対物レンズを通った発光がミラーを介さず直接カメラへ届くためロスが少ないという利点がある．倒立型でその構造を実現しているのがオリンパス社LV200である（プロトコール編-2を参照）．なおIX81にはボトムポートがあるため，同様の構造にセットアップすることも可能である．本稿では倒立型のIX83を例として説明する（図1A）．明視野観察用の白色光源および蛍光観察用の光源が備わっている場合は外さずにそのままで使用できるが，オンオフもしくはシャッターの開閉がソフトウェアを通して操作できるものに限る．

暗幕・顕微鏡台

顕微鏡全体を暗幕で覆うことを想定する（図1B）．床から骨組みを組むことで顕微鏡を設置する台ごと暗幕で囲む形，もしくは台の上に骨組みを組んで顕微鏡のみを囲む形のどちらかで準備する（本稿は後者）．蛍光観察を行う際に用いる市販の暗幕の流用でよいが，可能な限り遮光性の高い材質を選ぶ．撮影時は前面を完全に閉じて外部からの光を遮断するため，面ファスナーやファスナーの付いたものが望ましい（図1C）．外部と連結する各種ケーブルは袖を通してまとめて外へ接続する（図1D）．

カメラ

高感度でノイズの低いカメラが必須である．これまでは高解像度という点でも発光観察ではEM-CCDカメラが主流であったが，最近のsCMOSカメラは性能が向上しており，ビニング機能などが追加された製品も販売されていることから将来的に発光イメージングに導入できる可能性はある．本稿はEM-CCDカメラとしてiXonシリーズ（Andor Technology社）を使用した例を紹介する．他にはImagEMシリーズ（浜松ホトニクス社）を用いた経験もある．ゲインによる増幅は発光観察では不可欠である．

対物レンズ

微弱な発光を検出するために高開口数（NA）の蛍光観察用対物レンズが望ましいが，まずはお持ちのレンズで試してみるべきである．本稿では細胞内構造観察にはオリンパス社UPlanSAPO100×O（NA 1.40）を，複数の細胞観察にはオリンパス社UPlanSAPO20×（NA 0.75）を用いた．

フィルターセット

発光は微弱なため，光のロスを生むミラーやフィルターの使用は避けたいが，波長を分光して複数の発光を観察する場合には必要となる．通常の蛍光観察用のフィルターで十分であるが，蛍光スペクトルと比較して発光スペクトルはブロードであるため，分光が十分にできない場合もある．当然ながら蛍光観察との併用を行う場合もフィルターを準備する．本稿の観察結果ではフィルターは使用していない．

分光が必要ない対象では，フィルターなしの状態で光源のオンオフにより明視野と発光をそれぞれ撮影することが可能である．

観察ステージ

部屋を消灯して暗幕を完全に閉じた状態でなければ観察ができないような微弱な発光の場合には電動ステージが便利である．手動ステージでも観察は可能だが，発光像を観察しながらXY軸を調整する際には，できる限り光が入り込まないように部屋を真っ暗にして暗幕の隙間から手を入れてステージを操作する必要があり，慣れないと非常に時間がかかる作業となる．

PC・ソフトウェア

通常の顕微鏡観察でのデータ保存に耐えうるスペックであれば十分である．制御用ソフトウェアは各種光源のオンオフ，カメラの設定，フィルターの切り替えなどの制御ができることが絶対条件である．今回はモレキュラーデバイスジャパン社のMetamorphを使用した．

生細胞

本稿では生細胞を対象とする．ルシフェラーゼを一過的もしくは安定的に発現した細胞を，ガラスベースの観察用ディッシュ上で培養したものを準備する．本稿ではYellow enhanced- NanoLantern（YeNL）を安定発現するHeLa細胞および，Green enhanced-NanoLantern（GeNL）をミトコンドリアに安定発現するHeLa細胞を使用した^4）．

培地

観察時の培地は通常の蛍光観察で用いているものを使用すればよいが，添加する発光基質に影響が少ないものを使用する（よくあるトラブルを参照）．本稿ではHBSS（−）を用いた．発光基質はプロメガ社Furimazineを最終濃度20μMとなるように調製した．

プロトコール

1．光漏れの確認（所要時間10分程度）

❶ すべての装置の電源を入れる．

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❷ 暗幕内にある装置（顕微鏡，カメラなど）のLED部をすべて消去するかアルミホイルなどで遮光する^＊1．

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❸ 光路からの光の漏れがないか確認する（図2B）．照射光のオンオフ方法が物理シャッターなのか，光源内のオンオフによるものかを確認する^＊2．

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❹ 室内灯を点灯した状態で，暗幕内に頭を入れて外からの光の漏れがないかを確認する^＊3．

2．観察サンプルの準備（所要時間10分程度）

❶ インキュベーターから細胞を培養したディッシュをとり出し，培地を除く．

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❷ 最終的な分量の半分〜3/4量の観察用培地 〔HBSS（−）〕 を加える^＊4．

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❸ マイクロチューブなどに残りの観察用培地を分注する．発光基質を最終濃度を想定したうえで添加して，観察時に加えられるように準備する．

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❹ ステージにディッシュを置き，蓋を外す．

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❺ 顕微鏡を明視野観察の設定にして，おおよそのフォーカスと位置をあわせる．

3．基質の添加，フォーカスの調整（所要時間15〜30分）

❶ 顕微鏡撮影の条件を発光用の設定にする．光源はオフ，露光時間は1秒，カメラのゲインは最大にする^＊5．

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❷ すべての準備が整ったら，希釈しておいた発光基質を培地に添加する．暗幕の前面を閉じて完全に遮光する．

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❸ 露光時間を1秒に設定してライブ画像を取得する．この時点でフォーカスを変えてもぼやけた発光の影すら観察できない場合は，いったん明視野観察に戻してフォーカスをあわせ直した後，再び発光観察の設定にして露光時間を10秒，30秒，1分と長くして撮影を試みる^＊6．

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❹ 発光の白い“影”が確認できたら，フォーカスをあわせる．露光時間が1秒以内の場合はリアルタイムにあわせることができるが，それ以上の場合は撮影と調整をくり返してあわせていく^＊7＊8．

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❺ 最終的なフォーカス位置を決定した後は，露光時間を変えて撮影してみて，一番明確に像が撮影できる時間を探す．

Q．何も見えません．

A．明視野で細胞が確認できている場合，わずかでも発光していれば検出できる可能性がある．ゲインが設定できる場合は最大にする．さらに露光時間を最大5分程度に設定する．たとえフォーカスがずれていても白い影が映るはずである．長時間露光した際の背景のカウントの上がり方が異常な場合（全体が白くなるなど）は，遮光が徹底されているか再度確認する．

Q．時々，撮影画像にドットやコメットパターンのノイズが入ります．

A．宇宙線の衝突によるノイズと考えられる．発光観察における長時間露光では必ず付いて回る問題である．ソフトウェアによっては編集作業にて発光シグナルと区別してとり除く機能がある．

Q．蛍光標識も同時に観察しているのですが，蛍光観察の際に背景が異常に光ります．

A．発光基質は自家蛍光を生じるため注意が必要である．特に紫〜青色付近の励起光で光るため，Hoechstなどの染色マーカーは使用できない．蛍光との同時観察を検討する場合には波長の長いものを選択する必要がある．

Q．発光がしだいに弱くなっていくのですが．

A．特にセレンテラジン系のルシフェラーゼを使用している場合は，発光基質を添加した瞬間が発光のピークであり，そこから十数分〜数十分かけて徐々に発光が低下する．この変化は使用する培地組成によって大きく変わるため，より長時間発光が続く培地を探すことが重要である．血清は発光基質の酸化を促進するため発光の低下を早めることが知られている．

早い反応を追う必要がなく露光時間を長くすることが可能ならば，D-luciferin系のルシフェラーゼを選択して長時間露光で撮影すると，長時間安定して発光が観察できる．