無敵のバイオテクニカルシリーズ:改訂第4版 タンパク質実験ノート 下巻〜タンパク質をしらべよう(機能解析編)
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無敵のバイオテクニカルシリーズ

改訂第4版 タンパク質実験ノート 下巻

タンパク質をしらべよう(機能解析編)

  • 岡田雅人,三木裕明,宮崎 香/編
  • 2011年11月28日発行
  • A4判
  • 222ページ
  • ISBN 978-4-89706-944-9
  • 定価:4,000円+税
  • 在庫:あり
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タンパク研究の現状に合わせて内容を全面的に改訂.タンパク質の機能解析に重点を置き,相互作用解析の章を新たに追加したほか最新の解析方法を初心者にもわかりやすく解説.機器・試薬なども最新の情報に更新.

目次

第1章 タンパク質の機能解析の進め方【岡田雅人】

第2章 電気泳動によるタンパク質の分離同定

Ⅰ ポリアクリルアミドゲル電気泳動【奥村宣明】

Ⅰ-1 SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)
  • SDS-PAGE
Ⅰ-2 タンパク質の染色
  • CBB 染色
  • 銀染色
  • SYPRO Ruby 染色
Ⅰ-3 そのほかの電気泳動法

Ⅱ ウエスタンブロッティング【奥村宣明】

Ⅱ-1 タンパク質のメンブレンへの転写とPonceau S 染色
  • セミドライ式によるブロッティング
  • タンク式ブロッティングの場合【吉川由利子/岡田雅人】
Ⅱ-2 抗体との反応と抗原の検出
  • ブロッキングと抗体との反応
  • HRP 反応による抗原の検出- DAB 法
  • HRP 反応による抗原の検出-化学発光法
  • アルカリホスファターゼ反応による抗原の検出
Ⅱ-3 バンドの定量
  • ブロットの画像化とバンドの定量
  • その他の定量法
  • 参考:デジタル画像の基礎知識

Ⅲ 等電点電気泳動と二次元電気泳動【奥村宣明】

Ⅲ-1 二次元電気泳動とプロテオーム解析
Ⅲ-2  2 種類の等電点電気泳動法:CA-IEF とIPG-IEF
Ⅲ-3 IPG-IEF を用いた二次元電気泳動
  • 一次元目:IPG-IEF
  • 二次元目:SDS-PAGE
  • タンパク質の染色法,解析法
Ⅲ-4 CA-IEF を用いた二次元電気泳動

Ⅳ 質量分析によるタンパク質同定法【齊藤一伸】

Ⅳ-1 解析の進め方
Ⅳ-2 プロテアーゼによるゲル内消化(In gel digestion)
Ⅳ-3 サンプルの脱塩・濃縮

Ⅴ SDS-PAGE により分離されたタンパク質の回収法【宮崎 香】

Ⅴ-1 拡散法による抽出法
Ⅴ-2 電気泳動溶出法
Ⅴ-3 調製用電気泳動装置

第3章 抗体を用いたタンパク質の分離と分析

Ⅰ 抗体に関する基礎知識と抗体の作製法【宮崎 香】

Ⅰ-1 抗体に関する基礎知識
  • 抗体分子の構造と特徴
  • 抗体の反応性
  • 抗体の用途と選択
Ⅰ-2 抗体の作製法

Ⅱ 抗体カラムによるタンパク質の精製【宮崎 香/小柳 潤】

Ⅱ-1 実験操作の概略
  • 抗体の選択と精製
  • 抗体カラム
  • 抗原タンパク質の精製
Ⅱ-2 抗体の精製
Ⅱ-3 抗体カラムの作製
Ⅱ-4  抗体アフィニティークロマトグラフィーの操作法-抗ラミニンα 3 モノクローナル
  • 抗体カラムを用いたラミニン332 の精製

Ⅲ 免疫沈降法【山本和博/東 昌市】

Ⅲ-1  一般的方法と原理
  • モノクローナル抗体を用いる場合
  • ポリクローナル抗体を用いる場合
  • プロテインA,プロテインG,および二次抗体
  • 抗原- 抗体反応の条件
  • 溶出条件
  • 一般的な操作
Ⅲ-2  免疫沈降法を用いた細胞膜表層タンパク質の検出
  • -大腸癌細胞における細胞表層のE- カドヘリンの検出

Ⅳ 免疫染色法【森山佳谷乃/宮崎 香】

Ⅳ-1 主な実験条件
  • 検出法の選択
  • 抗体の選択
  • 標本の作製
  • その他
Ⅳ-2 ホルマリン固定・パラフィン切片の染色
Ⅳ-3 凍結切片の染色
Ⅳ-4 培養細胞の蛍光染色
  • 接着培養細胞の蛍光染色
  • 浮遊細胞の場合

Ⅴ ELISA による特定タンパク質の定量とタンパク質間相互作用の分析【森山佳谷乃/宮崎 香】

Ⅴ-1 ELISA の原理
  • 直接吸着法
  • サンドイッチ法
  • 競合法
  • タンパク質間相互作用分析と細胞ELISA(細胞を用いた受容体分析)
Ⅴ-2 標準曲線(スタンダードカーブ)
Ⅴ-3 サンドイッチ ELISA 法を用いた特定タンパク質の検出
Ⅴ-4 細胞ELISA 法(細胞膜受容体へのリガンドの結合分析)

第4章 タンパク質相互作用の解析

Ⅰ タンパク質間相互作用の検出

Ⅰ-1 生化学的解析
  • GST/MBP プルダウン【林 達也/三木裕明】
  • 共免疫沈降 船戸洋佑【三木裕明】
  • ファーウエスタン【上杉加奈美/三木裕明】
  • Blue Native PAGE【林 達也/三木裕明】
  • ゲル濾過によるタンパク質複合体の検出【船戸洋佑/三木裕明】
Ⅰ-2 表面プラズモン共鳴法【寒川 剛/高木淳一】
  • リガンドの固定化
  • 再生条件の検討
  • 測定
  • データ処理
Ⅰ-3 Two-hybrid 法【伊東文祥】
  • Two-hybrid 法の原理と基礎知識
  • Two-hybrid 法の実際

Ⅱ 蛍光タンパク質を用いた解析

Ⅱ-1 蛍光融合タンパク質を用いた細胞内局在・共局在の解析【片山博幸/宮脇敦史】
Ⅱ-2 FRET によるタンパク質間相互作用解析【下薗 哲/宮脇敦史】
  • 実験法の目的
  • 原理
  • 蛍光タンパク質を用いたFRET

第5章 タンパク質修飾の解析

Ⅰ リン酸化【岡田雅人】

Ⅰ-1 リン酸化の検出
  • リン酸化部位推測プログラムでの検討
  • 抗体を用いたリン酸化の検出法
  • 間接的なリン酸化検出法
  • ラジオアイソトープ(RI)[32P]標識によるリン酸化検出法
Ⅰ-2 リン酸化部位の同定
  • 質量分析計による同定
  • 部位特異的変異体などを用いた解析
Ⅰ-3 リン酸化の生理的意義の解析
  • リン酸化部位特異的抗体の作製
  • 生理活性や相互作用への影響の解析
  • キナーゼ阻害剤を用いた解析
  • 部位特異的変異体を用いた解析

Ⅱ ユビキチン化・タンパク質分解【佐野宗一/岩井一宏】

Ⅱ-1 ユビキチン化タンパク質の検出
Ⅱ-2 in vitro ポリユビキチンアッセイ
Ⅱ-3 ポリユビキチン鎖のタイプの決定
Ⅱ-4 タンパク質分解

Ⅲ アセチル化・メチル化【木村博信/田嶋正二】

Ⅲ-1  原理
Ⅲ-2 クロマチン免疫沈降法(ChIP)

Ⅳ 糖鎖修飾【相川京子/中野佑妃子/斎藤多佳子/松本勲武】

Ⅳ-1 レクチンを用いた解析
  • ブロット膜でのレクチン染色
  • 蛍光レクチン染色
Ⅳ-2 N 結合型糖鎖の酵素消化

Ⅴ 質量分析によるタンパク質修飾の解析法【齊藤一伸】

Ⅴ-1 質量分析によるタンパク質修飾解析の基礎知識
Ⅴ-2 主なタンパク質修飾の質量分析による解析
  • リン酸化
  • ユビキチン化
  • アセチル化・メチル化
  • 糖鎖修飾
  • 脂質修飾
Ⅴ-3 翻訳後修飾の予測とデータベース

Ⅵ タンパク質酸化修飾の解析【三木裕明】

Ⅵ-1 ジスルフィド(S-S)結合の検出
  • S-S 結合の性質
  • 非還元SDS-PAGEによるS-S結合の解析
Ⅵ-2 細胞内S-S 結合タンパク質の網羅的探索
  • 細胞内でのS-S 結合の還元的切断反応とその利用
  • TRX 変異体を利用したS-S 結合タンパク質の網羅的探索
Ⅵ-3 ROS 検出プローブを用いた解析

付 録【後藤直久】

1. 有用なインターネットサイトの紹介

2. 主な試薬の分子量

3. タンパク質分子量早見表

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【 有用なインターネットサイトの紹介 】

DNA塩基配列のデータベース

  • DDBJ(国立遺伝学研究所DDBJ)
  • GenBank(NCBI)
  • EMBL(EMBL-EBI)

    国際塩基配列データベースは上記3機関により構成されている.常にデータを相互交換しているため登録データは3機関で同一だが,検索画面や解析ツールは機関により異なる.実験で決定した塩基配列を論文に掲載する際はいずれかへの登録が必須である.

アミノ酸配列のデータベース

  • UniProt(SIB, EMBL-EBI and PIR)

    タンパク質のアミノ酸配列データベース.実験的に機能や特徴が知られているタンパク質のアミノ酸配列を専門家が収集整理したデータベースUni-ProtKB/Swiss-Prot, 塩基配列から予測される翻訳産物のデータベースUniProtKB/TrEMBL など目的別に複数のデータベースから構成される.2002 年にSwiss-Prot, TrEMBL, PIR-PSD の3つのアミノ酸配列データベースが統合しUniProt となった.

タンパク質一次構造モチーフデータベース

タンパク質立体構造データベース

  • RCSB PDB(RCSB)
  • PDBe(EMBL-EBI)
  • PDBj(大阪大学蛋白質研究所)

    タンパク質など生体高分子の立体構造データベース.上記3 機関によりThe Worldwide Protein DataBank が設立され,協調してPDB データを管理している.登録データは3 機関で同一だが,それぞれ独自の検索・閲覧・解析ツールを備えている.

タンパク質立体構造分類データベース

タンパク質情報データベース

ゲノム・生物資源データベース

ホモロジーサーチ

  • BLAST(NCBI)

    局所的に高い類似性を有する配列を検索するソフトウェア.UNIX, Mac OS X, Windows で動作.NCBI,DDBJ,EMBL-EBI,GenomeNet などのホームページからも利用できる.

  • FASTA(University of Virginia)

    BLAST より時間はかかるがより理論的に厳密な計算を行う.比較的長い領域にわたって低い相同性を示す配列の検索に適している.UNIX やMac OS Xで動作.DDBJ やGenomeNet などのホームページからも利用できる.

  • HMMER(Howard Hughes Medical Institute)

    隠れマルコフモデル(HMM)による高感度なホモロジーサーチソフトウェア.UNIX やMac OS X で動作.

マルチプルアライメント

  • ClustalW2(EMBL-EBI)

    マルチプルアライメントソフトウェアの定番.UNIX, Mac OS X, Windows で動作.EMBL-EBI やDDBJ,GenomeNet などのホームページからも利用できる.

  • MAFFT(産業技術総合研究所CBRC)

    高速かつ高精度なマルチプルアライメントソフトウェア.UNIX, Mac OS X, Windows で動作.EMBL-EBI やGenomeNet などのホームページからも利用できる.

PMFおよびMS/MS によるタンパク質の同定

  • Mascot(Matrix Science 社)

    質量分析データ解析ソフトウェア.Matrix Science社の製品.

  • ProteinProspector(UCSF Mass SpectrometryFacility)

    データベース検索を行うMS-Fit やMS-Tag,プロテアーゼ分解産物の質量を計算するMS-Digest など各種ツールが利用できる.

  • ExPASy Proteomics Tools(Swiss Instituteof Bioinformatics)

    アミノ酸配列の化学薬品やプロテアーゼによる切断後のフラグメントの配列と質量を予想するPeptide-Mass,アミノ酸配列からの予想と実際のマスマッピングのデータを比較し翻訳後修飾を発見するFindMod など各種ツールが利用できる.質量分析に限らずほかにもさまざまなタンパク質解析用ツールがある.

インターネット上のタンパク質配列解析ツール

解析ソフトウェア

  • ImageJ(NIH)

    バンドやスポットを定量するためのソフトウェア.Mac, Windows, UNIX で動作.

  • RasMol

    PDB に登録されている構造データ(.pdb 形式のファイル) の表示ソフトウェア.

  • PyMOL

    タンパク質立体構造の表示や解析を行うソフトウェア.

  • MODELLER(UCSF)

    ホモロジーモデリングを行うソフトウェア.

  • CCP4

    生体高分子のX 線結晶構造解析データ用ソフトウェア.

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