序文

第1章　事前の検討：手法の選択

Q1　器具は何を揃えればよいのでしょうか？

Q2　固定に関して，常に灌流固定を選択したほうがいいのでしょうか？

Q3　染色に用いる抗体の説明書に「凍結切片とパラフィン切片の両方が対応」と記載されているときはどちらを選択すればよいでしょうか？

Q4　ゼノグラフト組織でヒトとマウスの細胞を染め分けることは可能でしょうか？

Q5　マウスにヒト細胞を移植した組織で，ヒト由来のタンパク質のみを検出したいです

Q6　培養細胞を染色したいのですがどんな方法がありますか？

第2章　切片作製まで：解剖～固定

Q7　固定液はみんなが使っている4％パラホルムアルデヒドでいいですよね？

Q8　免疫染色用の組織の固定を4℃で行う方法もあると聞いたのですが，室温と比べてどちらがよいのでしょうか？

Q9　灌流固定が上手くなるポイントを教えてください

Q10　灌流固定後の浸漬固定の時間は，どのくらいがよいのでしょうか？

Q11　ホルマリン以外の固定液を使用しても染色できますか？

Q12　最近話題のグリオキサール固定液について，他の固定液との違いや選択方法などを教えてください

Q13　細胞培養したカルチャーインサートを使って凍結切片を作製すると，スライドガラスに貼り付けたサンプルが剥がれてしまいます

Q14　魚類など，マウス以外の生物の灌流固定はできますか？

Q15　ヒト組織の採取を行う場所に固定液を持ち込めない場合，どうすればよいですか？

Q16　ブロックの保存方法について教えてください

Q17　同じ組織を使って組織染色，遺伝子発現，タンパク質解析，酵素活性測定の試験を行いたいです．分解を避けるために組織固定を優先した方が良いですか？

第3章　切片の前処理：脱脂・脱灰，包埋，薄切

Q18　パラフィン包埋は一般的ないわゆる病理用の方法でよいのでしょうか？

Q19　エタノール～キシレン，パラフィンへの置換時間の目安を教えてください

Q20　灌流固定を行った組織片を凍結切片にするにはどうすればよいですか？

Q21　各工程の作業環境の温度は何℃がよいですか？

Q22　ブロックの薄切時は冷やして切った方がよいですか？

Q23　スライドの種類にはどのようなものがありますか？ どう使い分けますか？

Q24　疎水性と親水性のスライドガラスで使用法に違いはありますか？

Q25　脳，脊髄の染色でAPSのスライドガラスを選択する理由は？

Q26　同じサンプルでもスライドガラスを変えると形や大きさが変わってしまうのですが，なぜでしょうか？

Q27　骨を含む組織の脱灰には，EDTA系の試薬と塩酸系の試薬とでどのような違いがあるのでしょうか？

Q28　脂肪が多い組織を免疫染色する場合の注意点を教えてください

Q29　切片の厚みは何μmがよいのでしょうか？

Q30　パラフィンブロック薄切時の湯伸ばしで，長時間お湯に浮かべてもシワが伸びないとき，どうすればよいでしょうか？

Q31　凍結切片をスライドガラスに貼り付ける際に，シワや気泡が入ってしまいます

Q32　切片の保存方法について教えてください

第4章　染色工程：抗体選び，染色法

1）抗体関連

Q33　目的の抗体がいろいろなメーカーから販売されていて，探し方と選び方がわかりません

Q34　同じクローンのモノクローナル抗体が複数の会社から販売されているときはどのような基準で選択すればよいのでしょうか？

Q35　検体と一次抗体の産生動物を変える理由は何ですか？

Q36　マウス組織を染色したいのですがどうしてもマウス抗体しか見つかりません．どうすればよいでしょうか？

Q37　非モデル生物で免疫染色を行うときの抗体の選び方は？

Q38　抗体の最適な濃度の条件検討はどのように行うのですか？

Q39　抗体の原液濃度が記載されていないときはどうすればよいのでしょうか？

Q40　一度染色に用いた抗体を回収して使い回せるのでしょうか？

Q41　抗体はドライアイスを入れて冷凍で輸送してよいですか？

Q42　アイソタイプコントロール抗体での染色は必要でしょうか？

Q43　目的タンパク質にタグを付加して発現させたいのですが，免疫染色で検出できるタグを教えてください

2）染色工程関連

Q44　染色工程ってどれくらいの時間がかかりますか？

Q45　冷蔵・冷凍していたブロックや切片を用いて作業するとき，どのように温度を戻せばよいのでしょうか？

Q46　分子病理は行わずHE染色のみの場合，切片の保存温度は室温でよいのでしょうか？

Q47　脱パラフィン前のベーキングは意味がありますか？

Q48　過酸化水素処理はなぜ行うのですか？

Q49　ブロッキング剤の種類と使い分けについて教えてください

Q50　色々なブロッキングがあるようですが何をすればよいでしょうか？

Q51　二重染色を行いたいのですが，明視野と蛍光のどちらが良いでしょうか？

Q52　発色法で二重染色をするときも，一次抗体は別々の動物から作られたものを使う必要がありますか？

Q53　発色法の二重染色で必要な条件検討について教えてください

Q54　同じ切片を二重染色するのと，連続切片またはミラー切片で染色するのと，どのように使い分ければよいでしょうか？

Q55　抗原賦活化を熱処理で行う場合，バッファーや処理条件はどうやって選べばよいのでしょうか？

Q56　骨，軟骨，内耳など硬組織のパラフィン切片が熱処理で剥がれてしまいます

Q57　マイクロウェーブで賦活化を行うとムラができてしまいます

Q58　一次抗体を反応させる温度は4℃と室温と37℃とで違いが出るのでしょうか？

Q59　検出法としてLSAB法/ABC法/イムノポリマー法のどれを選ぶべきですか？

Q60　最適なDAB染色時間の決め方を教えてください

Q61　発色を確認する時の顕微鏡の設定について教えてください

Q62　リン酸化抗体で染色する場合，PBSを使用してはだめなのでしょうか？

Q63　抗体反応後の洗浄液はTBSとPBSのどちらがよいのでしょうか？また界面活性剤は入れたほうがよいのでしょうか？

Q64　同じ抗体を用いて蛍光法と発色法で染色する場合，賦活化方法や抗体濃度は同じでよいのでしょうか？

Q65　カウンターステインは必要ですか？

Q66　封入を失敗しました．やり直し可能ですか？

Q67　アルカリホスファターゼ標識抗体を用いて発色させたシグナルが，封入したら消えてしまいました．なぜですか？

3）蛍光染色関連

Q68　同じ分子を発色と蛍光で観察したとき，見え方はどう違いますか？

Q69　蛍光法で二重染色を行う際の一次抗体の選び方について教えてください

Q70　蛍光観察を行う際は何色が良いですか？

Q71　組織中の蛍光タンパク質をそのまま観察できますか？

Q72　蛍光バーチャルスライドのメリット・デメリットについて教えてください

Q73　蛍光染色の場合，切片の厚みはどのくらいがよいのでしょうか？

Q74　封入剤の選び方，使い方について教えてください

Q75　蛍光染色のスライドはどれくらいの間保存できますか？

Q76　二重染色の時の色の組み合わせはどのように決めればよいですか？

Q77　自家蛍光が気になります…

Q78　DAPI染色がムラになってしまいます

Q79　TSA法とはどういった手法なのですか？

Q80　ジェノスタッフでは蛍光標識二次抗体は何を使っていますか？

4）その他の染色

Q81　蛍光免疫染色の後に周辺組織の情報を得る方法はありますか？

Q82　TUNEL染色の注意点を教えてください

Q83　線維化の評価方法について教えてください

第5章　結果の評価：検出感度，バックグラウンド，染色ムラ，画像解析・定量

Q84　初心者がやりがちなミスについて教えてください

Q85　ネガティブコントロール抗体でも色がついてしまいます

Q86　染まるブロックと染まらないブロックがあり，サンプル間のばらつきで困っています

Q87　はじめて行う染色なのですがシグナルが全く出ません．どこを確認すべきでしょうか？

Q88　今まで染まっていた系なのに染まらなくなってしまいました

Q89　非特異的発色を減らすにはどうすればよいですか？

Q90　ネガティブコントロールとポジティブコントロールは必須ですか？

Q91　染色条件を検討するにあたりポジコンのサンプルをどう準備したらよいですか？

Q92　異なる組織を同じ抗体で染色する場合，プロトコールは同じでよいですか？

Q93　シグナルが弱いのですがどう対処すればいいですか？

Q94　蛍光染色でバックグラウンドが高いのですが，どうすれば改善できますか？

Q95　組織の周辺部でバックグラウンドが強く染まってしまいます

Q96　メラニンが多い組織で免疫染色を行いたいです．組織由来の色素とDAB染色を区別したいのですが，どうすればよいでしょうか？

Q97　免疫染色の染色ムラを改善する方法を教えてください

Q98　使ってみたけれどもうまくいかなかった試薬や器具はありますか？

Q99　思ったようなシグナルが得られないときの諦めどころはどこですか？どこまで条件検討すればよいのでしょうか？

Q100　蛍光強度の定量について，異なる検体間での相対化をどのように行えばよいのでしょうか？

Q101　DAB染色の茶色のシグナルだけを抽出することはできますか？

Q102　画像解析を行う際，1つのサンプルから1断面の解析で十分ですか？

索引