Smart Lab Life

クリスティーンは今日のラボミーティングで進捗を発表する予定になっている．彼女はラボメンバーに，ERAP（endoplasmic reticulum apoptotic protein）に関する研究の進展を説明するつもりである．

クリスティーンはERAPがどのようにUPR（unfolded protein response）によって制御されているか議論するつもりである．ラボメンバーが会議室に集まり，クリスティーンはPowerPointでプレゼンを始める準備ができている．

クリスティーン皆さんこんにちは．これからERAPに関する私の研究の進捗を詳しくお話したいと思います．気軽に質問を挟んでくださいね．

私はERAPがどのようにUPRによって制御されているか解析してきました．ご存知のとおり，UPRは３つのマスターレギュレーターによって制御されています．IRE1，PERK，そしてATF6です．私はβ細胞株INS-1 832/13におけるPERKのsiRNAによるノックダウン条件下では，ERストレス状態でのERAPの発現レベルが減弱していることを結論づけました．

ソーニャちょっと聞きたいんだけど，IRE1やATF6をノックダウンしてERAPの発現を測ったことはある？

クリスティーンとてもよい質問です．その実験は行っていまして，scramble siRNAを用いた対照サンプルとERAPの発現レベルに明確な違いは見られませんでした．

ウラノ先生今後を考えると，PERKによるERAP制御を確認するためには，他にどのような計画がありますか？

クリスティーンPERKノックアウトマウスの胚性線維芽細胞におけるERAPの発現レベルを測定しようと考えています．IRE1ノックアウトやATF6ノックアウトマウスの胚性線維芽細胞も同様です．またPERKを過剰発現させた際のERAPの発現も測ってみようと思っています．

先に進みますが，私はERAP発現においてeIF2αリン酸化に意味があるかどうかを知りたいと考えています．ERストレスによる活性化に伴い，PERKがeIF2αをリン酸化することからピンとくるはずです．リン酸化されたeIF2αは転写因子ATF4のような特定のmRNAの転写を促進する一方で，後半なタンパク質の翻訳を阻害します．私はINS-1 832/13細胞をeIF2αのリン酸化を誘導する化合物であるsalubrinalで処理しました．その結果，ERAP発現レベルの上昇が認められました．ここまでよろしいですか？

キャスリン別のことを急に思いついたのですが，コントロールとなる遺伝子は測定していますか？

クリスティーンはい．ATF4とCHOPの発現レベルを測りましたところ，salubrinal処理したINS-1 832/13細胞では両者とも上昇していました．salubrinalによるeIF2リン酸化レベルの上昇は，イムノブロットでも確認しています．

ウラノ先生PERKがERAP発現における転写因子を制御する可能性について，解析を始めたのではないかなと思っているのですが！

クリスティーンそうです．INS-1 832/13細胞でATF4とCHOPの両方をsiRNAでノックダウンしました．ATF4のsiRNAでは，ERストレス状況下でのERAP発現レベルの低下が見られました．ですがCHOPをノックダウンした時には何の違いも見られませんでした．ATF4-/-のマウス胚性線維芽細胞を使ったり，ATF4を過剰発現したりすることでこれらの結果を確認することは，やるべき事のリストに入っています．

ブライアンもう１つ質問があります．ATF4過剰発現によるERAPプロモーターの活性化を測定するため，ルシフェラーゼアッセイを行うのはどうでしょうか．次に，さらにATF4がERAPの転写因子であるかを確認するため，ERストレス条件下でのERAPプロモーターへのATF4のリクルートを，ChIP解析で測定すればいいんじゃないですか．

クリスティーンみなさん，アドバイスをありがとうございます．以前お話したように，私はERAP介在性のβ細胞死のメカニズムを研究し始めました．次の進捗報告では，それに関するデータを共有したいと思います．それでは皆さんさようなら，ご清聴ありがとうございました．