蛍光1分子の動きをビデオレート(30fps)程度で追跡し,一定時間後の原点からの距離の2乗を各時間にわたって平均した“平均2乗変位”を求めることで拡散定数を解析する方法である.微弱な1分子蛍光シグナルをコントラスト良く捉えるには30fps程度が限界であり,したがって1μm2/秒よりも速く拡散する分子は追跡ができず解析が難しい.