無敵のバイオテクニカルシリーズ:改訂 細胞培養入門ノート
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無敵のバイオテクニカルシリーズ

改訂 細胞培養入門ノート

  • 井出利憲,田原栄俊/著
  • 2010年05月28日発行
  • A4判
  • 171ページ
  • ISBN 978-4-89706-929-6
  • 定価:4,620円(本体4,200円+税)
  • 在庫:あり
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細胞培養で一番気を使うことは,雑菌の混入である.動物細胞等を培養中に,余計な雑菌(バクテリアやカビの類)が入り込んで増殖することをコンタミネーション(contamination:通称コンタミ )といって,これが起きないように注意する必要がある.動物細胞は増殖するときに多くの栄養素に加えて増殖因子を必要とし,増殖速度が遅い.それに対してコンタミする雑菌は増殖因子を必要とせず,細胞培養の培地のように栄養豊富な環境に飛び込むと,激しい勢いで増殖し,多くの場合,大切な細胞を死滅させる.ひとたび雑菌がコンタミすれば,雑菌を除去することはほとんどの場合,不可能である.…

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8度の増刷を重ねた大好評書がついに改訂!豊富な写真と細胞培養のスペシャリストによる丁寧な解説で,操作の意味をきちんと理解しながら培養の基本技術が身につきます!初学者だけでなく指導用にも最適の一冊!

目次

事前講義 細胞培養の基礎知識を学ぼう!

講義1● 細胞培養とは

講義2● 培養細胞の種類と特徴

1 細胞の一般的な性質
2 代表的な培養細胞

講義3●細胞培養でよく使う試薬や器具

講義4● 培養室の見学

1 培養室の意義
2 培養室へ入る前の注意
3 まず前室へ入る
4 無菌室へ入る

解説

  • 継代とPDL
  • 癌細胞とトランスフォーム細胞
  • 初代培養と株細胞
  • 線維芽細胞と細胞増殖因子
  • 空気(ホコリ)以外のコンタミのルート
  • クレゾール石けん液の廃液について

第1日 無菌操作の基本を身につけよう!

実習1● 培地替え

  • Step1 前室での準備
  • Step2 無菌室へ入る
  • Step3 クリーンベンチの用意
  • Step4 必要なものをクリーンベンチへ入れる
  • Step5 インキュベーターから細胞を出す
  • Step6 ディッシュの観察
  • Step7 培地替えのために培地を吸い取る
  • Step8 新しい培地を加える
  • Step9 ディッシュをインキュベーターにしまう
  • Step10 あとしまつ

解説

  • ピペッター使用の必要性
  • はじめから自分で工夫することの利点と欠点
  • 殺菌灯についてのQ&A
  • ビンのあぶり方
  • トレイでディッシュを運ぶときの注意
  • 培地の色は重要(pH指示薬としてのフェノールレッド)
  • 色のついていない培地もある
  • コンタミを見つける
  • ピペット捨てについて
  • クリーンベンチ内での操作について
  • 一度使用したピペットは再び培地ビンに戻さないこと!
  • 培地をこぼしたら
  • ゴミの始末

第2日 継代の方法と細胞数の計測法を身につけよう!

実習1● 細胞の継代

1 継代を行う前に知っておくべきこと
2 無菌室へ入る前に準備しておくこと
  • Step1 前準備
  • Step2 無菌室へ入る
  • Step3 細胞の確認と培地の準備
  • Step4 細胞を剥がす
  • Step5 培地を加え,トリプシンの作用を止める
  • Step6 細胞の観察とあとしまつ

実習2● 細胞を数える

実習2-1裸核にして細胞を数える
  • Step1 核浮遊液の調製
  • Step2 細胞の数え方
実習2-2裸核にしないで数える
  • 1 生きた浮遊細胞をそのまま数える(細胞を染色しない)
  • 2 生細胞のみを数える(トリパンブルー液を 用いた計測法)
実習2-3ディッシュに付着したままの細胞を数える

解説

  • トリプシン/EDTAの溶かし方
  • 研究室でまとめて作って管理する!
  • なぜロット番号まで記録しておくのか
  • 新しいディッシュの取り出し方
  • 前もって観察しておいてから実験を開始すべきである
  • 細胞の剥がれ方を観察してみよう
  • 剥がれたところと剥がれていないところの見分け方
  • ピペッティングによる細胞の損傷
  • 希釈について
  • ディッシュに均一に分散させるには
  • トリプシン/EDTAの持ち込みについて
  • 継代は最低2枚のディッシュにまく
  • ラバーポリスマンの使い方
  • アスピレートのやり方
  • クリスタルバイオレット液による核浮遊液の調製ついて
  • 細胞の数え方
  • 酔う人が少なくない
  • 混ぜた後どのくらい時間をおけば染色されるか,どのくらいの時間保てるか
  • 生細胞,死細胞の見分け方

第3日 正確な細胞数をまく技術を身につけよう!

実習1● 細胞浮遊液の正確な分注

1 実験前に考えておくべきこと
2 正確な分注のしかた
  • Step1 細胞浮遊液をつくり,分注する
  • Step2 細胞を数える

実習2● 少数細胞のまき込みによるコロニー形成

実習3● コロニーのギムザ染色

  • Step1 細胞を固定する
  • Step2 染色する
  • Step3 観察/コロニーを数える

解説

  • 一般的な懸濁のやり方
  • コロニーを数える
  • 顕微鏡での観察について

第4日 マルチウェルプレートの扱いとクローニングの方法を学ぼう!

実習1● マルチウェルプレートにまく

  • Step 1カバーグラスをマルチウェルプレートに入れる
  • Step 2細胞をまき込む

実習2● 細胞のクローニング

  • Step1 コロニーを選択する
  • Step2 コロニーを回収する

解説

  • カバーグラスへまき込むときのポイント
  • ディッシュにカバーグラスを入れて細胞をまく場合
  • クローニングの目的と方法
  • どのコロニーを選ぶか
  • 必要なコロニーに印をつける
  • 細胞は乾かさないように
  • いくつぐらいのコロニーを拾うか

第5日 増殖曲線の作成と応用実習にチャレンジしよう!

実習1● 増殖曲線を描く

1 実験操作で注意すべきこと
2 増殖曲線の描き方

実習2● 応用実習

実習2-0実験材料となる細胞の準備
実習2-1免疫染色
実習2-2細胞への遺伝子導入(トランスフェクション)
実習2-3放射性同位元素で標識する

解説

  • 増殖曲線についての解説
  • カバーグラス上の細胞の洗い方
  • カバーグラスを培養器から出して固定する場合
  • チミジンをチップで加えるときのコツ
  • 取り込まれたチミジンの算出法

特別実習 細胞培養に必要な準備を学ぼう!

実習1● 培養室のメンテナンス

実習1-1培養室の掃除
実習1-2インキュベーターの掃除
実習1-3炭酸ガスボンベの交換
  • 1 炭酸ガスゲージの見かた
  • 2 炭酸ガスボンベの交換

実習2● 器具・試薬の滅菌

実習2-1オートクレーブ
実習2-2乾熱滅菌
実習2-3濾過滅菌
  • 1 数十mLまでの濾過
  • 2 数十mLから数百mL程度の濾過
  • 3 大量の溶液(数Lから10 Lまで)の濾過
実習2-4ガラスピペットの洗浄と滅菌
  • Step1 ピペットの洗浄
  • Step2 ピペットの準備
  • Step3 乾熱滅菌

実習3● 共通試薬の調製

実習3-1培地を作る
実習3-2血清を非動化する
実習3-3トリプシン/EDTAを作る
実習3-4血清のロットチェック

実習4● 細胞の管理

実習4-1細胞を凍結保存する
実習4-2細胞を解凍する
実習4-3マイコプラズマの検出

● 特別実習を通じて

解説

  • なぜ綿を詰めるのか
  • 血清の非動化処理のしかた
  • 凍傷に対する注意
  • 爆発に対する注意
  • 温め方:液体窒素が消えたらなるべく急速に解凍する

本ページでは本書の補足として,著者の田原栄俊先生が行った細胞継代実験の実習の映像がご覧いただけます.下記にご紹介している映像は書籍で解説している内容のごく一部にはなりますが,実験を行う前の予習用として,また,本書で学んだことの復習用として,ぜひ,ご活用ください.

協力:文部科学省大学院教育改革プログラム(広島大学大学院医歯薬学総合研究科バイオデンティスト育成プログラム)

細胞を扱う前の準備1~培地ビンの準備,ピペットの取り出し方
  • [1] 細胞を扱う前の準備1~培地ビンの準備,ピペットの取り出し方

6分44秒 2010年5月25日公開

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細胞を扱う前の準備2~ディッシュの準備,ピペットの扱い方
  • [2] 細胞を扱う前の準備2~ディッシュの準備,ピペットの扱い方

12分20秒 2010年5月25日公開

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細胞の継代1~培地を吸い取る
  • [3] 細胞の継代1~培地を吸い取る

3分39秒 2010年5月25日公開

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細胞の継代2~トリプシンを添加し,細胞を剥がす
  • [4] 細胞の継代2~トリプシンを添加し,細胞を剥がす

6分50秒 2010年5月25日公開

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細胞の継代3~新たな培地に細胞をまく
  • [5] 細胞の継代3~新たな培地に細胞をまく

6分29秒 2010年5月25日公開

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SiHa細胞の継代
  • [6] SiHa細胞の継代

9分47秒 2010年5月25日公開

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後片付け
  • [7] 後片付け

3分51秒 2010年5月25日公開

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