クローズアップ実験法｜実験医学online：羊土社

2022年4月号 Vol.40 No.6 詳細ページ

生細胞の局在を反映した核可溶性画分の分画法

小川　泰

$345 生細胞での局在を反映した核可溶性画分の分画法小川泰何ができるようになった? 核タンパク質を生化学的に解析するにあたり,いくつかの分画方法や市販のキットが開発されているが,完全な核内プロテオームを得る方法はまだない.特に,核内可溶性タンパク質は,分画の際に失われることが多い.本方法は,より生細胞に近い組成で核可溶性画分を得るものである. 必要な機器・試薬・テクニックは? 主な必要機器は,血球計数盤,卓上の簡易遠心機,ブロックインキュベーター,ソニケーター,蛍光顕微鏡等である.必要試薬類は,ほとんどのものが購入可能である. はじめに原理核タンパク質の分画は 1960 年代から行われており, 細胞質画分と核画分の分画法は,一般的に,細胞膜当初は低張液によって細胞を膨張させ,ホモジナイザーの選択的破壊による細胞質画分の溶出と,核膜の破壊によって細胞膜を破裂させ,ショ糖密度勾配遠心法にによる核画分の溶出という ,たったの 2 段階のステッ 1) より核を分離していた .その後 ,界面活性剤を用いプで行われる(図 1).一見簡単に思えるが,3 つの注た,より簡略化された方法が広く使われるようになり, 意すべき点がある.1 つ目は,多くの核 - 細胞質間輸送今ではさまざまな分画キットが販売されている.しかは温度依存的であり,氷上のような低温で分画操作をし,これら市販のキットを用いて分画された核画分は, 行うと本来の局在から変化するタンパク質が存在する一部の可溶性核タンパク質が失われていたり,細胞質点である 2).そのため ,最初の細胞膜の選択的破壊は等の他の画分からのコンタミネーションを多く含んで 25 ∼ 37 ℃程度で行うことが望ましい.2 つ目は,細胞いたりすることがわかった.本稿では,これまでの方膜を破壊する際,核膜の完全性を維持することである. 法よりも,より生細胞の局在を反映した可溶性核タンこのステップで核膜を損傷すると,核内可溶性タンパパク質の分画方法を解説する. ク質は核外へ流出してしまう.市販の分画キットの多くは,この部分に問題が多いように思える.3 つ目は, 細胞膜を選択的に破壊し,核膜の完全性が維持されていても,比較的低分子量の核タンパク質が漏出する点 Fractionation methods of nuclear soluble fractions reflecting localizations in live cells Yutaka Ogawa:Cellular Dynamics Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research(国立研究開発法人理化学研究所開拓研究本部今本細胞核機能研究室) 実験医学 Vol. 40 No. 6(4 月号)2022 933$