改訂第３版 遺伝子工学実験ノート 上

第1章　実験をはじめるにあたって【田村隆明】

1 遺伝子実験とは

2 実験を組み立ててみる

3 実験法選択の基準

4 実験の上手な人はどこが違うのか

5 実験材料を準備する

6 遺伝子組換え実験関連法規

第2章　DNA実験の基本【田村隆明】

1 実験機具，機器

2 溶液

3 濃度と単位

4 滅菌操作

5 DNAの取扱い

6 DNAの検出と定量

7 DNAの濃縮

7-1　エタノール沈殿

7-2　イソプロパノール沈殿

7-3　有機溶媒で濃縮する

8 DNAの精製

8-1　フェノール抽出

8-2　フェノール/クロロホルム抽出

8-3　DEAE-セルロース

8-4　ゲル濾過

第3章　大腸菌の取扱い【田村隆明】

1 はじめに

2 大腸菌について

3 培養の準備

4 培地の作製

5 いろいろな培養法

5-1　液体培地での培養

5-2　プレート培養

5-3　大腸菌の増殖

5-4　培養後の後処理

6 菌株の保存と輸送

第4章　バクテリオファージの取扱い【与五沢真吾】

1 はじめに

2 ファージ力価の測定（プラークアッセイ）

3 ファージの増殖

4 ファージDNAの調製

第5章　プラスミドDNAの増幅と精製 −DNAを増やす【与五沢真吾】

1 プラスミドとは

1-1　プラスミドの基礎知識

1-2　プラスミドベクターの選択

2 プラスミドの調製

2-1　プラスミド調製の原理

2-2　ボイルプレップ

2-3　アルカリプレップ

3 ポリエチレングリコール（PEG）によるプラスミド精製

4 市販のキットを使ったプラスミド精製

5 形質転換（トランスフォーメーション）

5-1　コンピテントセルの作製

5-2　形質転換（トランスフォーメーション）

第6章　核酸の酵素処理 −DNAを加工する

1 はじめに【中太智義】

2 制限酵素処理【中太智義】

2-1　制限酵素とその特性

2-2　制限酵素反応の実際

2-3　DNAをマッピングする

3 リガーゼ【中太智義】

3-1　DNAリガーゼ

3-2　T4 DNAリガーゼの性質

3-3　キットについて

4 DNA修飾酵素【中太智義】

4-1　アルカリホスファターゼ （alkaline phosphatase）

4-2　DNAメチラーゼ（DNA methylase）

4-3　クレノーフラグメント（Klenow fragment）

4-4　バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ（Bacteriophage T4 DNA polymerase）

4-5　バクテリオファージT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Bacteriophage T4 polynucleotide kinase：T4 PNK）

5 ヌクレアーゼ【田村隆明】

5-1　S1ヌクレアーゼ

5-2　Mung Beanヌクレアーゼ

5-3　Bal31 ヌクレアーゼ

5-4　DNaseⅠ（デオキシリボヌクレアーゼⅠ）

5-5　エキソⅢヌクレアーゼ

5-6　ラムダエキソヌクレアーゼ

5-7　マイクロコッカルヌクレアーゼ

5-8　RNase H

6 DNA合成酵素【田村隆明】

6-1　末端デオキシヌクレオチド転移酵素

6-2　逆転写酵素

第7章　DNA断片のサブクローニング −目的のDNAを手に入れる

1 サブクローニングの流れ【中太智義】

2 インサートDNAの用意【中太智義】

3 ベクターの準備【中太智義】

3-1　制限酵素の選択とベクターの末端形状

3-2　脱リン酸化処理

3-3　ベクター調製の実際

4 ライゲーション【中太智義】

5 インサートDNAの修飾・改変【中太智義】

5-1　リンカーライゲーション

5-2　メチル化DNAを用いたリンカーライゲーション

5-3　突出末端の平滑化

5-4　DNAを削る

6 トランスフォーメーション （形質転換する）【中太智義】

7 インサートDNAのチェック

7-1　プラスミドの精製と制限酵素処理によるインサートチェック【中太智義】

7-2　カラーセレクション【中太智義】

7-3　PCRによるチェック【青木　務】

第8章　アガロースゲル電気泳動 −大きなDNA断片の分離

1 電気泳動の原理と種類【田村隆明】

2 アガロースを選択する【田村隆明】

3 試薬の調製【田村隆明】

4 電気泳動の実際【田村隆明】

5 DNAの検出

5-1　エチジウムブロマイドによるDNAの検出【田村隆明】

5-2　エチジウムブロマイドを含むアガロースゲルによるDNAの分離【田村隆明】

5-3　SYBR®Green染色を用いたDNAの染色【小池千加】

6 アガロースゲルからのDNAの回収【田村隆明】

6-1　GENECLEAN®を用いる方法

6-2　QIAGENのスピンカラムを使う方法

6-3　それ以外のDNA回収方法

第9章　ポリアクリルアミドゲル電気泳動−小さなDNA断片の分離【小池千加】

1 ポリアクリルアミドゲルについて

2 試薬の調製

3 ゲルの作製

4 電気泳動の実際

5 DNAの検出

6 ポリアクリルアミドゲルからのDNAの回収

第10章　PCR法 −DNAを試験管内で増やす【青木　務】

1 PCR法の原理

2 プライマーのデザイン

2-1　Tmとプライマーのデザイン

2-2　構造上避けるべきデザイン

2-3　その他のデザイン上の注意点

2-4　nested プライマー

3 耐熱性ポリメラーゼの選択

3-1　polⅠ型DNAポリメラーゼ

3-2　α型DNAポリメラーゼ

3-3　混合型DNAポリメラーゼ（LA-PCR用ポリメラーゼ）

3-4　Hot start用DNAポリメラーゼ

4 PCR反応の実際

4-1　PCRに用いられる機器の分類

4-2　PCR反応液の組成

4-3　サイクルの設定

4-4　PCR反応の例

4-5　コンタミネーションの防止について

4-6　Hot start

5 PCR産物のサブクローニング

5-1　PCR産物の精製

5-2　平滑末端化

5-3　TAクローニング法

5-4　制限酵素認識配列の付加